PeproTech的所有細(xì)胞因子和蛋白均為凍干粉，這使得運(yùn)輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細(xì)胞因子和蛋白凍干粉非常穩(wěn)定，在-20^o C或-80^o C條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系或注射入動(dòng)物體內(nèi)。溶解步驟非常關(guān)鍵，因溶解不好會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實(shí)際使用中經(jīng)常遇到的問題。

應(yīng)該如何進(jìn)行正確的溶解呢？

下面我們以Recombinant Human IL-5 (重組人IL-5，產(chǎn)品編號(hào)：200-04)的說明書為例，對(duì)細(xì)胞因子或蛋白的溶解方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述。

拿到重組人IL-5的說明書后，您會(huì)發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于Reconstitution(重懸)的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening

第 1 步：開蓋前離心試劑管

PeproTech的細(xì)胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉*溶解。

有很多用戶會(huì)問一個(gè)問題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長時(shí)間離心試劑管，才能達(dá)到良好的收集效果？

答：有些小型高速離心機(jī)(多為進(jìn)口品牌)的面板上有一個(gè)Spin鍵，按了此鍵后，離心機(jī)會(huì)自動(dòng)快速上升到其zui大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到zui高點(diǎn)后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個(gè)過程大約30s。這個(gè)Spin鍵足以很好的將細(xì)胞因子或蛋白收集到管底。

但有些實(shí)驗(yàn)室沒有這樣的高速離心機(jī)，只有zui高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機(jī)。這種情況下，需3000-3500rpm離心5min，也能達(dá)到類似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.

第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。

這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉

用于溶解細(xì)胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人IL-5需用水溶解，而重組人IL-2 (產(chǎn)品編號(hào)：200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人TGF-beta1 (產(chǎn)品編號(hào)：100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸)，pH3.0溶解，重組人FGF-basic(產(chǎn)品編號(hào)：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重組人FGF-10(產(chǎn)品編號(hào)：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉)，pH7.4溶解，重組IL-13(產(chǎn)品編號(hào)：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重組細(xì)胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的說明書為準(zhǔn))。后續(xù)的文章中將對(duì)各種溶解液的配制方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。

經(jīng)常有用戶會(huì)問，為什么會(huì)有這么多種溶解方法？

答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。PeproTech的細(xì)胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測試，說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白*溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能*溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。

有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用PBS或培養(yǎng)液(1640或DMEM等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？

答：有時(shí)可以，要看具體情況。PeproTech的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時(shí)千萬不能用PBS或培養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細(xì)胞因子，如重組人KGF(產(chǎn)品編號(hào)：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號(hào)：100-52)等，說明書上的溶解液即為1x PBS，此時(shí)用PBS溶解*沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過還是用先用PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。

2) 一定要溶解到的濃度。

蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，該例為0.1-1.0 mg/ml。這個(gè)濃度范圍對(duì)于不同的細(xì)胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產(chǎn)品編號(hào)：100-30)為0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B(產(chǎn)品編號(hào)：120-15)則一定要是0.5mg/ml。

高于或低于該濃度范圍會(huì)有什么問題呢？

答：首先，細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過該蛋白的zui大溶解濃度，即蛋白無法*溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，zui終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。

3) 一定不能振蕩(vortex)。

這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。

有用戶會(huì)問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的*溶解，該怎么辦呢？

答：多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子或重組蛋白*溶解。

對(duì)于不易溶解的細(xì)胞因子或蛋白，PeproTech會(huì)在說明書中進(jìn)行備注(Note)。如在重組人IL-13(產(chǎn)品編號(hào)：200-13)的說明書中您會(huì)看到：Slow to dissolve (緩慢溶解)，在重組人IL-11(產(chǎn)品編號(hào)：200-11)的說明中會(huì)看到： This solution is slow to dissolve.(該溶液溶解緩慢)。這種情況下，您能將要溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時(shí)間，促使細(xì)胞因子或重組蛋白*溶解。

有些蛋白，如重組人IL-13 Variant (產(chǎn)品編號(hào)：200-13A)雖然難溶，但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為：Allow the reconstituted vial to sit at 4^oC for at > 2 hours before use. (將重懸液在4^oC靜置2小時(shí)以上)

3. This solution can be stored at 2-8^oC for up to 1 week.

第 3 步：該重懸液在 2-8^oC zui長可保存 1 周。

用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8^o C，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性zui長可保持1周。這對(duì)一個(gè)周期為5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。

其實(shí)，說明書上推薦的濃度對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)來講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在4^o C保存，待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20^oC to -80^oC.

第 4 步：如要長期保存，則需用含載體蛋白 ( 如 0.1% BSA ，或 10% FBS ，或 5% HSA) 的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于 -20^oC 至 -80^oC 。

如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對(duì)細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20^o C至-80^o C，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。

經(jīng)常有人會(huì)在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20^oC至-80^oC，這樣可以嗎？

答：不行。我們知道，塑料管壁對(duì)多數(shù)蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的。做過ELISA實(shí)驗(yàn)的人都知道，ELISA的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶標(biāo)板上的。

載體蛋白，如1% BSA，10% FBS (胎牛血清)和5% HSA等的主要作用是預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)胞因子或重組蛋白不會(huì)粘附于管壁。如果在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋，而直接分裝凍存，則溶液中的大部分細(xì)胞因子或重組蛋白均會(huì)粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實(shí)際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大為降低，zui終表現(xiàn)為細(xì)胞因子或重組蛋白活性的下降。

因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。 稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。

那么，含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？

答：水不可。該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液(RPMI1640, DMEM等)等。

還有一個(gè)經(jīng)常被問及的問題，即在做無血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有BSA，FBS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，要想長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白該怎么辦呢？

答：一種方法是訂購PeproTech的小包裝(size A)細(xì)胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用后即廢棄。如覺得該方法過于浪費(fèi)，則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。

總之，為保證細(xì)胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中 Reconstitution 的方法嚴(yán)格操作。